精子转变为小蝌蚪时，有位低调的守护者
【编者按】在上海市科学技术委员会资助（项目编号：22DZ2304300）下，澎湃新闻联合《世界科学》对获得国家及上海市科技奖励的成果进行科普化报道。
本篇报道围绕2022年上海市自然科学奖一等奖项目“RNA调控在精子发生及男性不育中的新功能机制研究”展开，该奖项由中国科学院分子细胞科学卓越创新中心刘默芳研究员领衔获得。
中国科学院分子细胞科学卓越创新中心刘默芳研究员
2006年，刘默芳结束在美国约翰·霍普金斯大学医学院的研究生涯，回到中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所王恩多课题组担任副组长。刘默芳已经和RNA打了很多年的交道，此刻的她十分渴望能独自在RNA领域开拓出一片崭新的天地。
正好在那一年，RNA领域出现了一个重要的新突破。
包括华人科学家林海帆在内的多个研究团队，分别在小鼠、果蝇等多种模式生物的生殖细胞中发现了一类全新的小RNA分子。由于这类新型小RNA分子在果蝇生殖细胞中与Piwi蛋白结合在一起发挥功能，因此研究者们将其命名为Piwi 相互作用的RNA（Piwi interacting RNA），简称piRNA。
piRNA在生物体内可以算得上是非常“低调”的一类分子了：首先，piRNA集中存在于生殖细胞，在其他绝大多数的体细胞中基本上都不表达；其次，即使是在生殖细胞中，piRNA也并不会进一步合成蛋白质分子，仅仅是以RNA分子的形式默默存在着。
但与此同时，piRNA却有着很强的多样性，以小鼠的生殖细胞为例，人们就发现了超过一百万种不同序列的piRNA。
那么问题来了，为什么在生殖细胞中会表达种类如此繁多的piRNA？piRNA究竟具有怎样的生物学功能呢？
最初的几项研究纷纷发现，许多的piRNA序列都能匹配到一类名为转座子的DNA元件，进而抑制这些转座子序列的表达。
转座子是一大类能在基因组不同序列之间“跳跃”的分子，转座子的跳跃有一定的概率会导致基因突变，因此从长远来看是推动生物演化的重要动力之一。但对于生物个体来说，过于活跃的转座子并非好事，由此导致的基因突变会增加癌症等疾病的风险，因此此前人们已经发现细胞演化出了专门将转座子活性管控在一定频率以下的分子机制。
而具体到以精细胞为例的生殖细胞中，由于肩负着将遗传信息完整、精确传递到下一代的重要使命，研究者推测，在这里对于转座子活性的“管控”也会比其他细胞类型更加严格。
而piRNA的横空出世，完美地印证了这一推测：piRNA就好像是一道专门为生殖细胞额外添加的 “安检门”，保证转座子的活性在生殖细胞中被抑制在一个更低的水平。
但刘默芳却留意到，并非所有piRNA分子都能匹配到转座子序列。
那这些匹配不到转座子序列的“例外”piRNA分子是否还具有未知的生物学功能呢？
此外，科学家们在实验室里对小鼠、果蝇等模式动物进行基因敲除操作，破坏piRNA生成或功能，都会导致模式动物不能繁育后代。
那如果我们人的piRNA生成或功能出现故障，会导致怎样的后果呢？
刘默芳决定将这些问题作为自己团队的主要研究方向。
转座子之外的靶点
2010年，一个法国研究团队发现piRNA在果蝇胚胎发育的过程中参与对编码发育因子Nanos的信使RNA的降解，破坏piRNA的结合蛋白Aub会导致Nanos 信使RNA清除不及时，进而引起胚胎头部的发育出现缺陷。
这一发现首次表明除了转座子序列之外，能够编码蛋白质的信使RNA也可以成为piRNA的靶点，并接受其调节。
果蝇中发现的这个案例进一步坚定了刘默芳在哺乳动物中系统性地寻找piRNA新靶点和新功能的信心。
piRNA在小鼠精子形成过程中一个有趣的特殊性质为刘默芳提供了突破口：原来，在精子细胞最终形成蝌蚪形状成熟精子的过程中，存在着两波piRNA的表达高峰，其中匹配不到转座子序列的piRNA主要存在于第二波表达高峰。
因此，刘默芳团队首先从小鼠的睾丸组织中分离出处于第二波piRNA表达高峰中的精子细胞，进而纯化出包含piRNA的复合物。经过深度测序，他们惊喜地发现，在分离出的复合物与piRNA配对的RNA分子中，虽然超过2/3都是匹配到转座子序列的“经典”piRNA，但是仍然存在约20%是能够编码蛋白质的信使RNA。
接下来他们选择出十对互相匹配的piRNA和信使RNA，对它们之间物理上的相互作用进行验证，并通过功能学论证特异性piRNA的存在会促进对应信使RNA的降解。
如何理解这个发现的意义呢？
原来，piRNA促进信使RNA的降解主要发生在精子细胞从圆形向长杆形转化的过渡阶段。对于最终成熟的精子来说，为了能保证足够的运动能力，要尽可能地抛除可能会增加负重的材料。打个比方说，就像是神舟飞船，在发射升空的过程中会将带有多余重量的助推器逐一脱落，最终只剩下一个装载着宇航员的“大铁球”进入太空。而在形成精子的过程中，细胞从最初的圆形先转变为长杆形最终变为蝌蚪状，细胞中的大部分信使RNA都需要被清除干净。
而刘默芳团队的工作表明，piRNA在帮助精细胞减轻负荷的过程中发挥着关键作用。
换而言之，在精子形成的特定阶段，piRNA还扮演着“清洁工”的光荣使命。
能者多劳的piRNA：清除之外，还负责一部分生产工作
刘默芳团队前后选取了超过100对piRNA和信使RNA进行验证，其中绝大部分的piRNA都会促进信使RNA的降解，进而引起所编码蛋白质水平的降低。
但其中却出现了5对例外：研究者惊奇地发现，这些piRNA的表达并不影响对应信使RNA的含量；而对于所编码的蛋白质，piRNA表达不仅不会引起蛋白水平的降低，反而会导致蛋白水平的升高！
这离奇的现象，究竟是源自实验操作的失误，还是背后隐藏着未知的全新生物学原理？
刘默芳团队并没有轻易放过这5对意外的“例外现象”，通过对其进行深入挖掘，最终幸运地回答了精子发育领域的另一个重要问题。
“转录-翻译解偶联”现象是长期困扰精子发生领域研究者的一大谜团：精子细胞在发育的过程中，为了“瘦身”首先要对携带着基因组信息的细胞核进行压缩，而此操作却终止了细胞核内信使RNA的转录；为了保证生产出精子在后续发育过程中所需的蛋白质，精子细胞会提前合成出所需的信使RNA，并将其储存在一种名为“信使核糖核蛋白”（简称mRNP）的复合物中。mRNP就像是细胞临时搭建的一个“仓库”，保存在mRNP中的信使RNA处于“休眠”状态，翻译蛋白质的活性很低。
当精子发育推进到形状由圆形向长杆形转变时，保存在mRNP中的信使RNA会被有序释放出来，进而快速翻译产生精子发育后期所需要的蛋白质。
精子形成过程中这一先转录合成信使RNA，然后不立即翻译出蛋白，而是先保存在mRNP复合物中，等到时机成熟后再恢复翻译活性的机制被称作“转录-翻译解偶联”现象。
而刘默芳团队注意到，在能意外上调蛋白水平的5条piRNA中，恰好就有2条编码出的蛋白是对于精子发育后期非常重要的。
由此他们推测，piRNA是否就是推动mRNP释放信使RNA、重新激活蛋白翻译的关键分子呢？
事实也的确如他们所料：特定的piRNA能通过结合信使RNA末端的一段特殊序列，招募一系列的翻译调节因子，激活该信使RNA的翻译。
而且他们还发现，这一新机制不局限于此前发现的5个piRNA，进一步蛋白组学的实验结果表明，这种依赖于piRNA通路的翻译激活机制能推广到超过数百个不同蛋白。
这一发现进一步确立了piRNA在生殖细胞中“劳模”的地位：它们首先能在精子发育全程抑制转座子活性保证基因组的稳定性；其次还能重新激活保存于mRNP中信使RNA的翻译活性；最后在精子发育后期确保信使RNA的清除，使得最终成熟的精子能轻装上阵，具有较强的运动能力。
概括起来，刘默芳团队的这一系列研究工作，发现了piRNA对于精子细胞中的信使RNA存在着双重调控作用。
激活翻译的好帮手：能够相分离的FXR1
伴随着piRNA 对于“转录-翻译解偶联”现象功能的阐明，刘默芳团队对mRNP复合物在精子发育不同阶段的动态变化产生了强烈的兴趣。
可精子细胞是如何知道，该在什么时候重新激活蛋白翻译呢？
为了回答这个问题，刘默芳团队从幼龄和成年小鼠睾丸中纯化出处于高度活性状态的核糖体复合物，利用蛋白组学手段鉴定出了12个在成年小鼠睾丸中富集的翻译调控因子。其中，一个名为FXR1的蛋白引起了研究者们的格外兴趣。
伴随着精子细胞形状的改变，FXR1蛋白的表达量也逐渐升高。而且FXR1能结合上千种不同序列的信使RNA分子，促进相应蛋白的翻译。更有趣的是，FXR1的一个同源蛋白具有一种特殊的“相分离”性质——随着其浓度的升高，能在细胞中形成一类聚集在一起的特殊结构。
那么FXR1是否也具有类似的相分离性质呢？
体外的实验表明，随着浓度升高，FXR1的确可以形成相分离特有的结构。同时，在生殖细胞中敲除FXR1，会导致雄性小鼠出现不育的表型。
刘默芳团队由此做出了一个大胆的猜想：在精子发育的过程中，FXR1蛋白水平的升高，可能会通过相分离的机制将分散存在的mRNP复合物聚拢在一起，从而解除mRNP复合物对于翻译活动的抑制，推动精子发育进入下一个阶段。
为了验证这个猜想，他们设计了一个精彩的实验：通过突变筛选，研究者鉴定出了一个FXR1突变体。这个突变体与原版的FXR1相比只在一个关键位点的氨基酸存在差异，结合RNA分子的能力不变，但却失去了发生相分离的能力。当小鼠精细胞中的FXR1蛋白被替换成突变体版本后，研究者惊喜地发现，mRNP复合物的翻译激活能力显著降低了。
看来，FXR1蛋白的确很可能是通过相分离的机制来调控精子细胞翻译激活的。
这个发现开创性地阐释了相分离在精子发育过程中的重要作用。刘默芳团队于2021年5月25日把论文投稿到《科学》杂志。
但正是因为这一发现的意义重大，审稿人们对于论证的细节提出了许多谨慎的质疑。有趣的是，其中一位审稿人在审稿意见中写道：“即使相分离模型今后被证明是错误的，这项工作的发现也是新颖而重要的。研究人员做了大量工作，如果是我的评论延后了该工作的发表，我表示道歉……”
历经十个月时间的精心修改之后，刘默芳团队在2022年3月23日将添加了更多补充实验的论文重新递交到《科学》送审，最终在2022年的8月12日正式发表。
乘胜追击
从2006年到现在，刘默芳团队在piRNA领域精耕细作，不断地深化人们对于精子细胞发育调控机制的理解。
与此同时，他们也关心着基础研究给临床实践带来的帮助。其中发表在《细胞》上的一项工作就是课题组与上海市计划生育科学研究所合作，筛查了413例临床无精、弱精症患者，在3例病人中发现了Piwi基因存在突变。研究者通过敲入突变的小鼠模型论证病人携带的Piwi基因突变是导致不育的罪魁祸首，并揭示了此类突变的致病机理，且基于致病机理设计了干预策略， 能够一定程度上恢复突变小鼠精子的活力，为这类男性不育症患者的治疗提供了潜在的方法策略。这一工作首次证明了piRNA通路突变是男性不育的新病因。
继这一奠基性研究之后，刘默芳团队乘胜追击，与湘雅生殖医学中心合作，通过人类遗传学方法在病人中筛选男性不育相关的piRNA通路的新型基因突变。研究发现，原来除了Piwi基因以外，piRNA通路的其他元件的突变也会导致精子发育的异常。piRNA加工酶PNLDC1就是一个典型代表。此前国际上的同行已经利用小鼠模型论证PNLDC1的异常会导致雄性不育，并在2021年也采用和刘默芳类似的人类遗传学思路，从不育患者体内发现了多个导致PNLDC1功能缺失的突变。
刘默芳团队的发现与同行互相呼应，并且还在PNLDC1蛋白的活性位点上鉴定出了患者突变，进一步丰富了人们对于piRNA通路与精子发育关联的认识。
近期，她们又从男性不育症患者中鉴定到一个新的Piwi基因突变，该突变引起piRNA变短，从而导致piRNA消极怠工，不能很好地激活翻译、生产精子发育必需的蛋白质，从而影响了男性生育力。
这些工作为将来不育患者的筛查、治疗提供了坚实的理论基础。
piRNA通路，这一精子发育过程中的低调守护者，背后究竟还隐藏着多少未知的惊喜？
让我们拭目以待。
（作者黄宇翔是密歇根大学在读博士研究生，主要研究“细胞自噬的调控机制”，科普作品主要围绕生命科学及相关学科方向）
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