追问｜新研究实现体内递送mRNA靶向造血干细胞，非体内基因编辑
·将基因编辑工具更加高效、安全、特异性地递送到目标细胞，一直是科学家们的不懈追求，这将为安全便捷的基因编辑疗法开发提供有力的技术支撑，从而惠及更多遗传疾病患者。
·这项研究是关于体内靶向造血干细胞进行mRNA递送的一个进步，成功地做到了将mRNA通过LNP载体递送到了小鼠造血干细胞，并从概念上证明了通过LNP递送可以做到对造血干细胞的体外基因编辑，但是实际上距离造血干细胞的体内基因编辑还有一定差距。
来自美国费城儿童医院（Children’s Hospital of Philadelphia）和美国宾夕法尼亚大学（University of Pennsylvania）医学院的研究团队开发了CD117/ LNP-mRNA，该系统利用脂质纳米颗粒（LNP）封装mRNA，并在LNP上偶联了造血干细胞（HSC）表面的干细胞因子受体CD117，实现了LNP的造血干细胞靶向。基于CD117/LNP系统的基因编辑器递送在体外实验中几乎完全纠正了有缺陷的镰状红细胞，使用CD117/LNP在体内递送促凋亡因子PUMA mRNA可耗竭HSCs，从而有望代替骨髓移植中对人体有害的化疗清髓药物。
相关论文于当地时间7月27日在线发表于最新一期的《科学》（Science）杂志。论文作者表示，该系统在体内递送mRNA靶向造血干细胞的能力，使得开发新型的清髓策略成为可能，可以作为体内基因组编辑治愈遗传疾病的基础。
mRNA，中文译名“信使核糖核酸”，是由DNA的一条链作为模板转录而来的、携带遗传信息能指导蛋白质合成的一类单链核糖核酸。在这项研究中，研究人员设想，将编码基因编辑器或其他蛋白的mRNA装在脂质纳米颗粒中，把这些小颗粒注入体内，让它们去找造血干细胞，然后释放负载直接对其进行改造。为此，他们在脂质纳米颗粒表面装上了“导航”——CD117抗体，用于识别造血干细胞表面的受体。在多项测试实验中，这套系统均可以成功实现体内mRNA表达和Cre递送介导的荧光蛋白激活。
随后，研究人员使用CD117/LNP封装的mRNA编码Cas9基因编辑器，测试该系统是否可以用于治疗基因突变导致的血液病。他们使用镰状贫血病患者捐献的细胞进行体外测试，发现CD117/LNP能促进高效碱基编辑，使正常功能性血红蛋白的比例增加；从细胞形态来看，有缺陷的镰刀状红细胞几乎完全消失。
小鼠实验显示，CD117/LNP成功将封装的mRNA递送到了造血干细胞。图片来源：《科学》论文
研究人员还探讨了LNPs是否可以用于体内递送导致造血干细胞耗竭的mRNA，这将建立一套不依赖于对人体有害的化疗药物，便可以清除患者自身骨髓细胞，用于造血干细胞移植的新策略。他们使用CD117/LNP封装了促进细胞凋亡的蛋白质PUMA，在小鼠身上开展的概念性验证实验结果显示，注射CD117/LNP-PUMA能在造血干细胞移植之前有效耗竭原有的自体造血干细胞，从而成功输注和吸收新的健康骨髓细胞。
利用CD117/LNP递送促凋亡分子PUMA，可以在小鼠体内耗竭造血干细胞，用于造血干细胞移植（HSCT）前准备。图片来源：《科学》论文
论文第一作者、费城儿童医院血液科助理教授Laura Breda博士表示：“这些发现可能会改变基因疗法，因为不仅可以在体内对特定细胞类型进行基因编辑，而且风险更低，可以对造血干细胞进行以前做不到的操作，同时这套系统还可以经过适当的调整，用于纠正其他多种单基因疾病。”
基因编辑是一种新兴的比较精确的能对生物体基因组特定目标基因进行修饰的一种基因工程技术。体外基因编辑是从患者体内采集的细胞在体外进行基因编辑后，再作为治疗药物重新注入患者体内；体内基因编辑则指基因编辑过程发生在体内细胞中。
华东师范大学生命科学学院研究员吴宇轩向澎湃科技表示：“这项研究是关于体内靶向造血干细胞进行mRNA递送的一个进步，成功地做到了将mRNA通过LNP载体递送到了小鼠造血干细胞，并从概念上证明了通过LNP递送可以做到对造血干细胞的体外基因编辑，但是实际上距离造血干细胞的体内基因编辑还有一定差距。要在人体中实现对于造血干细胞的体内基因编辑，还需要更多的临床前实验，包括直接通过LNP递送基因编辑器到造血干细胞实现真正的体内基因编辑。” 通过在造血干细胞中基于CRISPR的基因编辑治疗以地中海贫血为主的血液疾病是吴宇轩的研究方向之一。
【对话】
澎湃科技：你如何评价这项最新研究？
吴宇轩（华东师范大学生命科学学院研究员）：Breda等人在最新一期的《科学》杂志上的这篇关于LNP-mRNA（脂质纳米颗粒包裹的信使核糖核酸）体内递送的文章引起了领域内的广泛关注。将基因编辑工具更加高效、安全、特异性地递送到目标细胞，一直是科学家们的不懈追求，这将为安全便捷的基因编辑疗法开发提供有力的技术支撑，从而惠及更多遗传疾病患者。
这项研究是关于体内靶向造血干细胞进行mRNA递送的一个进步。骨髓中的造血干细胞可以通过不断分裂、自我更新和分化产生多种血液细胞和免疫系统，建立体内整个血液系统，其功能的重要性毋庸置疑。异体造血干细胞移植治疗白血病和遗传性血液病在临床上已经应用了很多年，基于造血干细胞的基因治疗在近年来也飞速发展，已经走向了临床，对镰刀状贫血和地中海贫血等疾病的治疗产生了远超传统疗法的疗效。
在该研究中，研究人员将造血干细胞表面特异性的膜蛋白c-KIT（也称为CD117）的抗体偶联在LNP上，然后再用这种LNP包裹mRNA，使得包裹mRNA的LNP能够靶向表达造血干细胞。在应用层面，该研究做了几点尝试：
第一，将位点特异性重组酶Cre的mRNA通过LNP递送的方式递送到携带特定基因序列（前面带终止序列的荧光蛋白基因）的造血干细胞，然后Cre可以把终止序列切掉，荧光蛋白得以表达，从而证明了该LNP系统可以成功递送mRNA到造血干细胞。
第二，将编码促凋亡蛋白的mRNA递送到造血干细胞，证明了用这套系统可以开发一个新的对人体伤害更小的造血干细胞清除策略（因为骨髓移植之类的治疗方案，必须预先把患者体内已有的造血干细胞用大剂量化疗药物杀死，为即将移植的造血干细胞腾出“归巢空间”）。
第三，将分离得到的镰刀状贫血患者的造血干细胞在培养皿中与包裹了基因编辑器mRNA的LNP孵育，在体外成功编辑了造血干细胞，修复了致病突变。
综上所述，该研究成功地做到了将mRNA通过LNP载体递送到了小鼠造血干细胞，并从概念上证明了通过LNP递送可以做到对造血干细胞的体外基因编辑，但是实际上距离造血干细胞的体内基因编辑还有一定差距。通过Cre mRNA的体内造血干细胞递送实现特定基因序列的修饰，只适用于携带特定DNA序列的工具鼠，无法直接转化到人体临床。
要在人体中实现对于造血干细胞的体内基因编辑，还需要更多的临床前实验，包括直接通过LNP递送CRISPR/Cas9基因编辑器或者碱基编辑器到造血干细胞实现真正的体内基因编辑。
我们的一项相关研究也正在进行中，通过筛选和优化新型LNP，在不偶联抗体的情况下，便获得一些可以直接通过体内递送高效靶向人类造血干细胞的LNP，并实现了高效率的体内基因编辑，这项研究目前正在投稿当中。
澎湃科技：近几年，体内基因编辑领域有哪些重要进展？
吴宇轩：我们知道，蛋白质是人体各项生命活动的主要承担者。理论上mRNA可以编码任意类型的蛋白质，通过各种方法将mRNA递送到细胞内，借助细胞内的蛋白质翻译机器，可以将mRNA翻译成特定功能的蛋白质。目前研究较为广泛的方法包括脂质纳米颗粒以及病毒载体等等。
经过多年的技术积累，LNP体内递送方法成名于新冠mRNA疫苗的开发和大规模应用。但是，LNP体内递送不仅限于新冠病毒抗原mRNA，也可以用于基因编辑工具甚至是肿瘤新抗原mRNA，从而实现体内基因编辑药物以及肿瘤疫苗的开发。
目前国际上已有通过LNP以mRNA形式递送的体内基因编辑药物获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准，进入临床试验。Intellia公司的NTLA-2001和NTLA-20022是通过把基因编辑器的RNA包裹在LNP中，通过静脉给药的方式，使其进入肝脏，从而编辑靶基因，起到治疗作用，目前临床数据显示，一次给药可以在长达一年的时间里起到治疗效果。理论上这类体内基因编辑药物能起到“一次给药，终生治愈”的效果，是药物开发史上的里程碑事件。
在其他组织和细胞靶向领域，之前已有研究通过将特定抗体偶联LNP实现T细胞递送，在本研究中，研究者通过抗体偶联LNP实现了造血干细胞递送。相对肝脏细胞，造血干细胞更难实现LNP递送，因此该研究有一定的意义。
澎湃科技：相比体外基因编辑，体内基因编辑有何优势？面临什么样的挑战？
吴宇轩：相比体外基因编辑，体内基因编辑具有以下优势：
1. 更广的适应症：人体内很多细胞是很难进行体外培养、编辑和回输这一系列操作的，例如肝脏，最好的方式就是直接把编辑器递送到体内，直接编辑靶细胞。
2. 更高的安全性：体外基因编辑通常需要编辑后的细胞再移植回到患者体内。例如基于体外编辑造血干细胞的细胞治疗，需要将造血干细胞从患者体内收集再回输，回输前还要对患者进行清髓化疗，而清髓过程对患者会有伤害。体内基因编辑避免了这些问题，因为编辑是在患者体内完成的。
3.更低的药物制备成本：体内基因编辑药物天然是一个通用性药物，可以一次大量生产后供大量患者使用，单个药物成本可以做到相对较低。
4.更简单的给药方式：无需繁琐的治疗前预处理和细胞制备，可直接输注生产好的LNP-mRNA药物。
尽管体内基因编辑具有许多优势，但也面临一些挑战：
1. 递送技术：体内基因编辑需要将编辑工具准确地送到目标组织或细胞中，因此，递送技术是一个重要的挑战。研究人员需要开发出高效、安全的递送系统，以确保编辑工具的准确送达。
2. 安全性：体内基因编辑需要确保编辑的准确性和安全性。不正确的编辑可能导致意外的副作用，因此需要谨慎评估编辑的安全性。在脱靶风险方面，体内基因编辑和体外基因编辑差别不大，唯一的区别在于体内环境更加复杂，递送的基因编辑工具可能会对非目标细胞进行编辑，这是需要考虑的重点之一。
3. 特异性：体内基因编辑需要确保编辑工具对目标基因具有高度特异性。尽量避免对其他细胞进行不必要的编辑，以减少潜在的副作用。
4. 监管和伦理问题：体内基因编辑涉及对人体进行基因修改，因此涉及一系列监管和伦理问题。确保研究和临床应用符合伦理标准和监管规定，但又不过分收紧，将使得体内基因编辑药物的研究走向对全人类有益的方向，造福广大患者，。
总的来说，体内基因编辑是一个有巨大潜力的领域，随着基础研究和临床试验的不断发展，可以为治疗遗传性疾病、慢性疾病和癌症等疾病带来新的治疗选择。
澎湃科技：相比AAV递送，LNP递送有何优缺点？
吴宇轩：AAV（腺相关病毒）和LNP（脂质纳米颗粒）是两种常见的基因递送系统，它们各自具有不同的优缺点。
AAV递送的优点：
1. 长期表达：AAV可以导入宿主细胞的基因组中，实现持久的基因表达，其递送的基因可以在宿主细胞中稳定表达数月甚至多年。
2. 适应范围广：AAV可以感染多种类型的细胞，包括非分裂细胞，目前在临床上，已经有了靶向肝脏、眼睛和肌肉的AAV基因治疗药物。
AAV递送的缺点：
1. 载体大小限制：AAV的基因载体大小有限，不适用于递送较大的基因序列。
2. 预存抗体：部分人群对AAV有预先存在的抗体，可能导致治疗效果受到影响；或者一次给药后产生了抗体，限制了多次治疗的可能性。
3.免疫反应导致的毒副作用：AAV病毒会诱发人体免疫反应，严重的时候甚至可以致命，同时患者需要长期给予免疫抑制剂控制过度的免疫反应。
LNP递送的优点：
1. 载体大小灵活：LNP可以递送比较大的RNA。
2. 低免疫原性：适当组分的LNP，以及完善的制备工艺，可以使得LNP具有极低甚至检测不到的免疫原性，适合多次反复给药。
3. 瞬时递送：LNP-mRNA递送方式的表达时间窗口非常短，导入的mRNA通常在两天左右就会完全降解，结合基因编辑器的递送反而是优势，因为将基因编辑器表达限制在非常短的时间窗口，降低了脱靶风险。
LNP递送的缺点：
1. 短期表达：与AAV相比，LNP递送的基因表达持续时间较短，如果是递送mRNA进行酶替代疗法或者增补性治疗，需要频繁的给药来维持治疗效果。
2. 细胞选择性较差：LNP递送往往比较难以实现针对特定类型细胞的高度选择性递送，目前临床上特异性最好的就只有肝脏细胞。上述的造血干细胞递送研究，也不可避免地会将mRNA同时递送到肝脏，当然这一点会随着该领域的发展而得到解决。
综合来看，AAV递送在长期稳定表达方面具有优势，适用于对于罕见病的增补性治疗；而LNP递送目前结合基因编辑已经被证明了其出色的安全性和有效性，同时由于其极低的免疫源性和快速降解的特点，在罕见病中得到概念验证后，将来极有可能被应用到慢性病、常见病领域。实际上，美国Verve公司治疗高胆固醇血症（一种全球高发的慢性心血管疾病，会引发动脉粥样硬化甚至心肌梗死）的药物，已经处于临床一期，让我们拭目以待。
（华东师范大学生命科学学院副研究员廖娇阳对本文亦有贡献）