人羊膜上皮细胞在妇产科相关疾病中的应用以及研究进展（下）
原创 医学参考报 干就有未来
撰文│王璐璐 赖东梅
编辑│毕紫娟
审校│汤红明
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近年来，人羊膜上皮细胞（human amniotic epithelial cells，hAECs）用于妇产科相关疾病的治疗逐渐成为研究热点，包括早发性卵巢功能不全、子宫内膜损伤、复发性流产等，前期我们介绍了hAECs的生理学特点及hAEC在早发性卵巢功能不全中的作用，本期将继续介绍hAECs在子宫内膜损伤、子宫瘢痕、妇科肿瘤及复发性流产中的作用。
一
hAECs对子宫内膜损伤和子宫瘢痕的修复作用
子宫内膜分为功能层和基底层两个部分，功能层在每个周期中通过生长、转化、剥脱和再生修复等一系列过程不断循环再生。随着人工流产、宫腔镜等宫腔手术操作的逐渐增多，子宫内膜损伤变得越来越常见。轻度损伤可触发局部炎性反应，促使上皮细胞再生，使子宫内膜达到无纤维瘢痕修复；重度损伤累及子宫基底层，可使子宫内膜细胞减少，腺体数量减少，失去正常分泌功能。炎症细胞浸润吞噬上皮细胞，间质外露，间质细胞的纤维活性增加，子宫内膜功能层和基底层失去正常界限，形成上皮再生障碍，无法对激素刺激产生应答，子宫内膜纤维粘连增生，纤维粘连间质中缺乏血管形成瘢痕，引起宫腔部分或完全纤维化，最终导致宫腔缩窄、扭曲甚至宫腔消失，形成宫腔粘连（intrauterine adhesions，IUA）， 即Asheman综合征。该病导致月经过少、闭经、不孕症、反复流产、慢性盆腔痛等问题，严重困扰患者，但至今仍无有效预防和治疗措施。IUA的治疗措施主要聚焦于重建正常的子宫结构并恢复子宫功能，宫腔镜粘连溶解术治疗及术后放置球囊并结合激素疗法是目前治疗IUA的主要方法，但效果欠佳且复发率高。近年来，众多学者开始研究应用外源性干细胞移植来改善子宫内膜损伤，并取得了一定进展，为临床治疗重度子宫内膜损伤获得妊娠机会提供了新思路，例如使用骨髓来源的间充质干细胞、子宫内膜干细胞、经血干细胞、脐带干细胞和脂肪干细胞等进行移植都可帮助子宫内膜再生；联合应用雌激素和子宫内膜干细胞治疗IUA可使受损子宫内膜再生并逆转纤维化，改善子宫内膜微环境并重新建立子宫内膜功能，显著提高了IUA治疗效果。子宫内膜损伤模型大鼠采用脂肪干细胞移植治疗后，受损的宫内膜微血管密度、宫内膜厚度及腺体均明显增加，且生育能力得到了改善等。但仍然存在许多担忧：脂肪干细胞移植可能会促进癌细胞生长，而子宫内膜干细胞与多种妇科疾病的发病机制有关，如子宫内膜癌、子宫内膜增生、子宫内膜异位症、子宫内腺肌病等，以及这些干细胞的致瘤性、免疫原性等限制了这些干细胞在子宫内膜修复领域的应用。
笔者所在课题组采用机械损伤建立了小鼠IUA损伤模型，进行人羊膜上皮细胞（hAECs）移植治疗IUA的研究， 结果发现hAECs移植治疗后， 受损子宫内膜中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、增殖细胞核抗原（PCNA）及雌激素受体（ER）表达水平增加，这说明血管生成能力和基质细胞增殖能力得到改善，hAECs 促进子宫内膜增厚、内膜腺体增加、胶原沉积减少，产生了更多微血管。子宫内膜形态得到改善，从而使得IUA模型小鼠的妊娠率和产仔数增加。同时，也有研究表明，经过hAECs移植治疗的IUA模型鼠的促胶原沉积信号分子表达明显抑制，如α-SMA、TGF-β1及TGF-β2等， 但抗纤维化分子TGF-β3在治疗组中表达水平显著上调。此外，IUA模型小鼠的子宫内膜基质细胞中存在自噬（自噬是细胞面对环境压力时一种自我保护而主动降解的过程，即分解衰老细胞器并在缺乏营养时提供能量）抑制现象，而在体外hAECs与子宫内膜基质细胞的共培养系统中，观察到hAECs可激活受损子宫内膜基质细胞中的自噬，因此，hAECs可通过激活子宫内膜基质细胞的自噬来促进子宫内膜修复。
子宫瘢痕憩室（cesarean scar defect, CSD） 是剖宫产术后常见远期并发症之一，定义为剖宫产术子宫瘢痕因愈合不良而导致子宫肌层停止生长，子宫瘢痕处肌层变薄，形成一个与宫腔相通的凹陷或腔隙。随着剖宫产技术的开展，全球CSD的患病率为45.6%～ 64.5%。CSD可引起月经期延长、月经间期流血、慢性盆腔痛、经期腹痛等，此外还可引起继发性不孕、瘢痕妊娠、前置胎盘、子宫破裂等产科并发症。改善CSD患者的临床症状或妊娠结局的最佳治疗方法尚无共识。因此，迫切需要开发一种新的CSD治疗方法。笔者所在课题组在体外构建了大鼠剖宫产憩室模型，并且将hAECs注射到子宫瘢痕周围，发现hAECs可通过上调内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）促进血管生成并上调基质金属蛋白酶-8（matrix metalloproteinase-8，MMP-8）减少胶原沉积，从而对子宫瘢痕进行修复，同时也改善了妊娠结局。
总之， 当前研究表明，hAECs的移植治疗可抑制子宫内膜纤维化的进展，并促进子宫内膜血管生成和再生来促进子宫内膜损伤修复，同时，也能通过促进瘢痕血管生成和降解瘢痕胶原来修复子宫憩室瘢痕。
二
hAECs的抗肿瘤作用
新血管的形成是胚胎发育、正常生长及组织修复的重要生理过程。血管生成失调是癌症的基本病理特征之一。肿瘤血管生成对肿瘤输送氧气和营养至关重要，同时在肿瘤病理的其他方面如代谢失调及肿瘤扩散转移中也发挥着关键作用。肿瘤内促血管生成因子和抗血管生成因子间的不平衡会导致异常血管网络建立，其特征是血管扩张不成熟、弯曲混乱和高渗透性。异常的血管网络会引起肿瘤血流及氧合时间和空间异质性及肿瘤间质液压力升高。异常血管网络不仅促进肿瘤生长和转移，还导致化学疗法、放射疗法和免疫疗法功效降低。因此，肿瘤脉管系统的正常化已成为一种新的治疗策略。通过血管正常化即重建肿瘤血管结构和功能，恢复适当的肿瘤灌注和氧合作用，有利于肿瘤微环境的代谢状况改善，可能会限制肿瘤细胞的侵袭性并提高抗癌治疗效果。hAECs来源于胎盘，由于其端粒酶活性丧失，具有非致瘤性，同时也具有低免疫原性、多能干细胞的特征和调节血管形成的能力，因而被广泛用于组织工程，以增加血液灌注并促进伤口愈合。研究发现，将荧光标记hAECs经尾静脉注入子宫内膜癌模型鼠中，hAECs归巢于子宫肿瘤组织，通过分化为肿瘤血管内皮细胞或血管外周细胞，整合到子宫内膜癌血管结构中，从而增强肿瘤血管的完整性，减少肿瘤血管生成失调，使肿瘤血管的结构和功能正常化，提高了肿瘤血管灌注效率，增强了化疗药物顺铂的细胞毒性作用。另外，hAECs对上皮性卵巢癌细胞（epithelial ovarian cancer，EOC） 也具有抑制作用，hAECs通过分泌的TGF-β1介导癌细胞的细胞周期停滞在G0/G1期，从而对EOC生长发挥抑制作用。近年来，诸多体外内研究表明，羊膜（AM）细胞可能通过抗增殖和促凋亡，以及调节血管生成和细胞周期等，抑制肿瘤生长和侵袭，从而发挥抗癌作用，且hAECs在调节血管生成和诱导癌细胞凋亡方面起着重要作用，有望成为抗肿瘤治疗的候选者。
因此，AM来源的hAECs不仅可用于再生医学，而且还可通过调节血管生成和分泌细胞毒性的细胞因子来发挥抗癌作用，hAECs及其衍生物为妇科恶性肿瘤的抗肿瘤治疗提供了新的治疗选择，但将其转化为临床应用仍需要进一步研究。
三
hAECs对复发性流产的免疫调节作用
复发性流产（recurrent spontaneous abortion，RSA）是育龄期女性的一种常见疾病，发病率为1%～ 5%。复发性流产的病因复杂，包括染色体异常、解剖结构异常、感染、内分泌因素及免疫性疾病等，然而多达50%～75%的复发性流产病因不明，又称为原因不明的复发性流产（unexplained recurrentspontaneous abortion，URSA）。胚胎成功植入和妊娠的维持需要母体对胎儿产生免疫耐受，即在保障妊娠期间胎儿免受母体免疫系统攻击的同时也要保障对病原体产生防御功能。因此，母胎界面正常免疫稳态的建立对顺利妊娠至关重要。研究表明，辅助性T（Thelper Th）细胞及其相关的细胞因子在母胎免疫调节中起着重要作用。Th细胞被抗原呈递细胞激活后，开始克隆扩增并向Th细胞几个亚群分化，包括Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞和Treg细胞等，同时分泌细胞因子，形成各自的细胞因子谱，从而决定随后的免疫应答类型。母胎界面的Treg细胞的减少和Th17/Treg比值升高可能会形成母体不适当的胎儿免疫耐受，导致URSA的发生。同时，细胞因子在母胎间的信号传导中也起着重要作用，Th1细胞通常分泌促炎性细胞因子， 例如IFN-γ、TNF-α和IL-2，发挥抑制胚胎植入和诱导流产的作用，同时Th2细胞可分泌抗炎细胞因子，例如IL-4，IL-6 和IL-10， 通过其免疫抑制作用对同种异体反应产生免疫耐受性，有助于维持妊娠。若外源性或内源性因素引起的Th1/Th2比例失衡，母体胎界面免疫耐受就会被破坏，从而导致妊娠终止。
hAECs位于与羊水接触的胎盘最内层，除了具有多能干细胞特性外，还通过发挥免疫调节作用参与胎儿耐受性维持。据报道，hAECs对被刺激的T细胞激活、增殖和促炎因子（IFN-γ 和TNF-α）的产生都有明显抑制作用，且hAECs来源的外泌体， 可通过旁分泌方式介导母胎之间信号传导，发挥免疫调节作用，参与分娩启动。有研究表明，hAECs对URSA患者的幼稚Th细胞具有强大免疫调节作用，包括抑制Th细胞增殖，促进Th细胞向亚群Treg细胞分化，使细胞因子谱偏向Th2模式及抑制Th1及Th17细胞因子产生。同时，也有研究表明，hAECs降低了从URSA患者体内分离出幼稚CD4+T细胞活化的能力。TGF-β1的表达在T细胞活化后会上调，并在活化T细胞增殖和分化中发挥关键作用，但hAECs会使得活化T细胞的TGF-β1表达显著降低，并将hAECs与幼稚T细胞共培养后，取上清液检测观察到TGF-β1水平降低。因此，hAECs对URSA患者的幼稚T细胞活化具有较好免疫调节作用。由于hAECs不表达HLA Ⅱ和共刺激分子，hAECs治疗避免了临床应用后免疫排斥的风险。
四
总结
胎盘通常在分娩后作为医疗废物被丢弃，且胎盘的获取无须其他任何侵入性操作即可获取。因此，不会引起其他干细胞来源固有的伦理问题。首先，一张AM可分离获得约2亿个hAECs，可制备足够数量的hAECs用于疾病治疗。其次，hAECs暂未获得与年龄或环境相关的DNA累积损伤的新生细胞，免疫原性低。最后，hAECs具有遗传稳定性，移植到免疫缺陷小鼠体内不会形成肿瘤。因此，与其他干细胞相比，hAECs具有很大优势，是干细胞治疗的理想种子细胞。越来越多研究表明，hAECs及其衍生物可修复或替代病变、衰老的组织器官并促进器官功能恢复。在妇产科领域，hAECs已被用于卵巢功能修复治疗、子宫内膜损伤修复治疗，剖宫产憩室的修复治疗，妇科恶性肿瘤抗肿瘤治疗，复发性流产免疫调节治疗等研究中，具有广阔应用前景。
目前， 干细胞研究的临床转化仍有许多待解决的问题，如干细胞产品质量的稳定性、细胞来源、治疗效果评估等方面。因此，干细胞要真正应用于临床，仍需要进行多中心、大规模、前瞻性的临床研究评估，最终以最简单、最经济、最安全的方法实现其最佳疗效，从而为今后hAECs 在妇产科等相关难治性疾病治疗中的临床应用打下坚实基础，尽早惠及更多患者。
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作者简介
赖东梅 教授
现任上海交通大学医学院附属国际和平妇幼保健院主任医师，博士研究生导师。致力于干细胞与生殖健康研究。国际上首次进行采用人羊膜上皮细胞移植修复卵巢功能的基础与临床研究。以第一作者或通信作者发表专业论文100 余篇，其中SCI论著80余篇；承担包括国家重点研发计划、国家自然科学基金等课题20余项；荣获上海市科委浦江人才计划，上海市卫生系统优秀学科带头人及高峰高原“研究型医师”计划等项目资助；以第一发明人申报国家发明专利13项，获美国发明专利授权1项，国家发明专利授权7项。项目成果《人羊膜上皮细胞促进人胚胎干细胞生长的研究》荣获上海市第29届优秀发明选拔赛优秀发明金奖；《人羊膜上皮干细胞移植治疗卵巢早衰的临床研究》获2022年国家卫生健康委第二届科技创新大赛应用基础研究铜奖。
《医学参考报》干细胞与再生医学专刊
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