Renewables | 中国科学院物理研究所王雪锋：将冷冻电镜从生物学扩展到材料科学

第一作者：李伟萍

通讯作者：王雪锋

通讯单位：中国科学院物理研究所先进材料实验室

DOI：10.31635/renewables.024.202300046

本文亮点

冷冻电镜（cryo-EM）技术已成为研究辐照敏感材料的高分辨率图像和材料科学低温特性的重要工具。然而，人们对于功能材料和生物大分子的冷冻电镜原理尚不清楚，二者之间的差异也未明确阐明。本文总结了生物材料和功能材料在冷冻电镜工作流程上的异同，重点是样品制备和转移、成像模式和数据处理方面的差异。此外，还回顾了冷冻电镜在有机物、无机物和界面领域取得的最新成果。最后，探讨了冷冻电镜面临的挑战，并展望了未来冷冻电镜的一些新技术。

研究背景

电子显微镜（EM）分辨率的不断提高促进了一些重大科学突破，如新材料及其新物理性质的发现、纳米科学和疾病研究。荣获2017年诺贝尔化学奖的cryo-EM（cryo-EM）极大地促进了结构生物学研究的发展。尤其是自2013年之后，通过使用直接电子探测器，电子显微镜的分辨率显著提高，从而能够在原子尺度上表征生物大分子。迄今为止，随着样品台更为稳定、人工智能（AI）和高通量计算系统的发展，冷冻电镜已成为一门日益重要的学科。

由于cryo-EM可以通过降温和减少成像辐射剂量来有效减轻电子束对样品的辐射损伤，科研人员已开始将cryo-EM应用于其他对电子束敏感的材料，如锂/钠电池材料和界面。在低温条件下，电池材料的固有结构和相关的界面或相结构可得到很好的保持，并可在纳米/原子尺度上成像，提供与电池电化学性能相关的化学成分和结构信息。此外，利用cryo-EM测量超低温下的特殊性质也促进了对超导材料、高熵材料和量子材料的了解。除了晶体结构外，电子能量损失光谱（EELS）和能量色散 X 射线光谱（EDS）的应用有助于分析元素分布和化学键合作用。此外，原位电子显微镜还能实时观测纳米尺度的动态过程，为相变和反应的发生提供宝贵的见解。原位透射电子显微镜（in-situ TEM）能够深入了解材料在不同工作条件下（如温度、压力和不同外部刺激）的行为。通过捕捉和分析原子和分子层面的实时变化，有利于对材料科学复杂性的探索和理解。最近，利用四维扫描透射电子显微镜（4D-STEM）技术可以同时获得晶体取向、应变分布、电场或磁场分布以及传统STEM 图像。总之，冷冻电镜不仅在生物学领域发挥着重要作用，在材料科学领域也具有重要意义。

近年来，关于冷冻电镜在材料科学中的应用已发表了多篇综述，涉及电池材料、界面和纳米科学等领域，为冷冻电镜的未来发展方向提供了宝贵的信息。然而，人们对功能材料和生物大分子的冷冻电镜原理还不甚了解，它们之间的区别也没有明确阐明。中国科学院物理研究所王雪锋研究员在Renewables发表题为“Expanding the Cryogenic Electron Microscopy from Biology to Materials Science”的展望。本文从这一角度总结生物材料和功能材料在冷冻电镜工作流程上的异同，重点关注样品制备和转移、成像模式和数据处理。此外，还介绍了冷冻电镜近年来在功能材料领域取得的一些最新成就。

图文导读

考虑到功能材料与生物大分子之间的差异，将冷冻电镜从结构生物学转移到材料科学时必须考虑这些差异。因此，本文的第一部分详细介绍了生物大分子和功能材料在冷冻电镜工作流程方面的异同，旨在建立这两个领域之间的联系，相互学习，共同推动冷冻电镜的发展。

样品制备的正确性是冷冻电镜获得可靠分析结果的重要前提，因为它决定了成像和分析样品的质量（图1a）。首先，微栅上的颗粒应分散、随机取向、薄且无污染。每个制样步骤都可能对取样质量产生重大影响，如pH值、缓冲溶液等因素。对于生物大分子，通常采用印迹法和冷冻玻璃化法制备样品，这种方法能很好地保留样品的原始结构，通过快速玻璃化将伪影降到最低，并且在操作得当时能提供一致的结果（图1b）。该方法非常适合液态样品或能均匀分散到液体中的样品。然而，实现最佳玻璃化厚度是一项挑战，样品厚度的变化可能会影响所获图像的质量。处理较大或较厚的样品时，该方法也会遇到困难，因为要在整个微栅上形成玻璃状薄冰层会受到限制。

如果感兴趣的样品较大、埋在大块中或要求特定的取向，则建议使用聚焦离子束（FIB）（图 1c）。为减少铣削过程中的束流损伤，可以考虑采用低温处理。尽管这种方法有效，但即使在低温条件下也难以避免光束损伤。此外，它还具有成本高、耗时长和整体复杂性高等特点。另一种方法是在微栅上手动分散样品，或通过原位生长，如在微栅上电化学镀锂（Li）/ 钠（Na）金属（图 1c）。如果样品对空气敏感，则需要专门设计的支架或容器来处理和转移样品，以免暴露在空气中。这些方法的选择取决于实施的难易程度、可重复性和具体要求等因素，因此需要根据样品的性质和冷冻电镜的预期结果做出明智的选择。

尽管近年来冷冻电镜技术发展迅速，但正确的样品制备仍是一大瓶颈。因此，除了制定冷冻电镜样品制备的标准操作程序外，还应针对具体样品进行定制和优化。此外，可以通过开发新型方法或研发新型设备进一步提高制样效率和样品质量，并在必要时扩大冷冻电镜在各种样品中的应用。

图1. 生物分子和功能材料的样品制备和转移。（a）低温电镜样品制备步骤概述。（b）生物分子样品制备流程。（c）功能材料的样品制备和转移工作流程

除了传统的高分辨率透射电子显微镜（HRTEM），针对光束敏感的生物大分子和功能材料还开发了一些先进的成像技术。其中包括单颗粒重建技术（SPRT）、低温电子断层扫描（cryo-ET）和微电子衍射（micro-ED）。SPRT利用一系列计算机图像处理步骤，包括粒子选择、图像配准、二维分类和三维（3D）重建，以获取蛋白质和其他大型生物实体的高分辨率三维结构。与传统的X射线晶体学相比，SPRT能够在接近自然生理条件下分析无定形蛋白质的结构（图2a）。Cryo-ET通过逐渐增加的倾斜角度获取同一区域的倾斜序列投影，并进行重建，以获得样品的三维结构。而微电子衍射则是一种将电子束射向微小样品以获取衍射图样的技术，适用于处理微小且可能无序的样品，能迅速提供结构数据（图2b）。

另一项功能强大的技术是四维扫描透射电子显微镜（4D-STEM），也称为空间分辨衍射测量法（图2c）。在扫描后，记录下的4D数据集包含了局部晶体取向、结构变形和结晶度等信息。4D-STEM技术取得了显著进步，特别有利于研究脆弱的生物样品和敏感材料，并最大限度地减少了每个区域的曝光时间。此外，利用现代显微镜的低剂量模式和后处理技术，还可进一步提高图像质量。快速扫描技术、低温样品制备和优化探测器技术的结合，有助于将潜在的样品损坏降至最低，使4D-STEM成为在保持样品完整性的同时获取高分辨率见解的有力工具，对晶体、半晶体、无定形和混合相等对光束敏感的材料更具吸引力。

除晶体结构外，元素化学分析对功能材料也至关重要，可通过能谱分析（EDS）和电子能量损失谱（EELS）获得相关物化性质的来源（图2d）。EDS可检测样品在电子束激发下发出的X射线，是识别和量化各种元素、提供成分和分布的强大工具。而EELS则可测量电子穿过样品后的能量损失，从而提供关于电子和化学状态的信息，是一种多功能的分析技术。

图2. 生物分子和功能材料的成像模式。（a）SPRT工作原理示意图。（b）Cryo-ET的工作原理示意图。（c）用于材料的4D-STEM。（d）用于材料的EELS

获取原始图像和光谱后，需要进行数据处理，以挖掘具有代表性的特征。数据处理涉及多个步骤和算法，包括分割、跟踪、量化、可视化、分析和建模（图3a）。幸运的是，计算机科学家和图像分析师正在不断开发更先进的计算方法，并将其集成到用户友好的软件工具中，大大提高了分析的准确性和便利性（图3b）。特别是对于SPRT，采用最大似然程序对记录的帧进行重新调整、平均、分类，并重建大分子复合物，从而提高了信噪比。cryo-EM采用子图谱平均化程序，将模式与参考对齐，然后提供平均图像，有助于减少随机噪声，，突出共同的结构特征（图3c）。

与生物学高度自动化的数据处理过程不同，功能材料的cryo-EM图像自动化程度不高，我们建议进行统计分析，以获得可靠和有代表性的结果。这包括从随机区域收集数据，从图像中提取感兴趣的相关细节，然后计算频率，得出统计结果（图3d）。为了进一步提高数据处理效率，机器学习（ML）等新兴技术有望发挥重要作用。尤其是卷积神经网络在图像分析任务中非常有效。此类算法经过训练可自主识别、分割和分析TEM数据集中的特定结构或属性。此外，它们还能从噪声中分辨出真正的结构细节，从而在不影响数据质量的前提下，采用先进的降噪方法。在冷冻电子显微镜中集成ML不仅能提供实时分析功能，还能重新定义电子显微镜中的数据处理和自动化。ML 算法固有的适应性、速度和准确性有助于采用更复杂、更敏捷的方法来理解复杂的显微结构，最终提升这些尖端显微技术的能力（图3e）。

综上所述，应用适当的工作流程是获得可靠结果的先决条件。有效的工作流程应首先防止任何样品污染，并能确定样品的本征状态。因此，将低温超微切片和冷冻FIB 技术用于样本制备很值得探讨。此外，进一步引入人工智能和统计方法将有助于实现任务自动化、高通量采样、提高准确性。

图3. 数据处理。（a）生物图像分析的常规步骤。（b）SPRT成像的三个主要步骤。（c）cryo-ET亚层析图平均化分析。（d）非均匀功能材料冷冻透射电镜图像的统计分析。（e）用于数据处理的深度学习模式

传统电子显微已被用于研究有机材料的微观结构，以深入了解它们的组成和排列。然而，传统方法存在一些局限性，如电子束对样品的损伤导致分辨率有限，以及需要进行化学固定，给保存生物样品的原生状态带来了挑战。cryo-EM技术能够减轻辐射对有机材料的损伤，并为研究原生状态下的成核、生长和（自）组装过程中的结构变化提供了机会。例如，水凝胶微球在药物输送系统和可穿戴纳米技术应用中显示出巨大潜力，但使用传统的电磁波很难辨别膨胀状态下纳米复合微凝胶的形态和内部结构。利用cryo-EM技术，可以保持纳米复合微凝胶的原始结构，并发现微凝胶内部的十二烷基硫酸钠（SDS）聚集体是聚苯乙烯（PS）的成核点，阻止了PS粒子的融合（图4a）。对于基于聚合物小分子受体（PSMA）的全聚合物太阳能电池来说，聚合物供体/受体的均匀分布对于实现高效率至关重要。冷冻电镜证实，在氯仿中的Pn-Se混合前驱体溶液中，聚合物供体/受体在预聚合状态下具有互穿网络，而在Pd-Se混合前驱体溶液中具有约8-16 nm的相分离尺寸，这解释了Pn-Se混合前驱体溶液具有更高的效率（图4b）。Li等人首次利用低温TEM技术获得了ZIF-8的原子分辨率图像，显示了单个MOF纳米粒子中的主客体相互作用（图4c）。Li等人展示了利用增强型低温连续旋转电子衍射（cryo-cRED）测定多晶三维COF结构的一般方法，其分辨率可达0.79 Å，完整度超过90%（图4d）。这种方法在解耦COF结构与性能之间的关系以及开发具有卓越性能的新材料方面显示出巨大潜力。

图4. Cryo-EM在有机物方面取得的一些成果。（a）聚苯乙烯（PS）纳米颗粒在 pNIPAm/聚苯乙烯与十二烷基硫酸钠（NS-SDS）纳米复合材料内形成的Cryo-ET图。（b）Pn-Se 和 Pd-Se 混合前驱体溶液在氯仿中的cryo-EM 图像。（c）唑基咪唑啉框架（ZIF-8）的高分辨率的框架结构cryo-EM图像 (ZIF-8) 。（d）用于多晶三维（3D）COFs 结构测定的增强型低温旋进电子衍射图

在无机材料领域，冷冻电镜可以进一步应用于揭示辐射敏感无机材料的微观和纳米结构，特别是在锂离子电池（LMB）和功能材料的低温特性领域。2017年，Wang等人率先采用冷冻电镜技术研究了电化学沉积金属锂（EDLi）的纳米结构、化学成分和固体电解质界面（SEI）（图5a）。在0.5 mA cm-2时，最初5分钟内HRTEM图像及其相应的FFT图样均未显示属于结晶锂金属的晶格或体心立方衍射图样，这表明形成的是无定形EDLi。随着时间的推移，靠近表面的一些EDLi区域开始结晶，并逐渐扩展到主体。发现与结晶锂相比，玻璃态锂具有更好的电化学可逆性，是锂金属阳极的理想微观结构。对于目前锂离子电池（LIB）中使用的传统石墨负极，石墨锂化在不同阶段的阶次转变方式几十年来一直是一个有争议的话题。Wang等人利用cryo-EM揭示了石墨在Li+插层过程中阶段性结构的独特特征，其中Li+不均匀地嵌入石墨夹层，产生局部应力，形成位错和其他缺陷。每个阶段的石墨在宏观上有序，但在微观上不均匀（图5b）。到目前为止，cryo-EM已成为电池领域捕捉Li+行为及其与不同阴极/阳极材料相互作用的重要工具，为推动LMB的发展提供了宝贵的基础。

cryo-EM的另一个重要应用场景是研究材料在低温下的特殊性质。在77 K和4.2 K下获得高熵铁钴铬镍合金的cryo-HRTEM图像，其表明低温诱导了从面心立方结构到六方紧密堆积结构的相变（图5c）。Kourkoutis等人利用cryo-EM技术，观察到氧化物异质结构在低温（93 K）下皮米级的原子位移，表明锰氧化物在室温和低温下的电荷有序性存在差异，为理解电荷有序态的底层结构和其他复杂现象铺平了道路（图5d）。此外，Li等人还进一步拓展了低温4D-STEM（cryo-4D-STEM）层析成像技术的发展，实现了沸石的原子分辨率成像。

图5. 冷冻电镜在无机物方面取得的一些成就。（a） EDLi 在 0.5 mA cm-2 下 5、10 和 20 分钟的冷冻电镜图像及其相应的快速傅立叶变换图。（b）锂化石墨的冷冻-TEM 图像。（c）在 77 K 和 4.2 k 条件下获得的高熵铁钴铬镍合金的冷冻-TEM 图像、相应的电子衍射图样和 HAADF-STEM 图像。（d）量子材料的 HAADF-STEM 图像

界面是一个复杂的系统，具有特殊的物理化学性质，对电势分布、电荷转移、离子传输和结构稳定性等各种因素都有重大影响。然而，固态电解质界面（SEI）的性质一直是一个争论不休的话题，原因在于其复杂性和辐照敏感性，使得传统电镜很难对其进行表征，尤其是在高分辨率下。2017年，Cui等研究人员利用cryo-EM直接观察了在不同电解质条件下形成的SEI的组成和结构，为了解SEI的形成机理和Li+在其中的传输提供了依据。在碳酸盐基电解质中形成的SEI层含有小晶畴，随机分散在无定形基质中，而在添加10%（体积分数）的氟乙烯碳酸盐（FEC）后形成的SEI层则呈现多层结构，更加有序（图6a）。随后，他们发现各种电解质中的SEI都具有膨胀性，且与电池性能高度相关，这在过去是不被认可的。此外，利用低温电镜直接观察到SEI中存在LiH，解决了一个长期存在争议的问题。

Wang等研究人员结合FIB和cryo-EM，成功揭示了锂/LiPON界面的多层镶嵌结构，其中氮和磷的浓度呈梯度变化。从锂阳极到LiPON，主要相为Li和Li2O（区域1）、Li2O和Li3N（区域2）、Li2O、Li3N和Li3PO4（区域3），最后是LiPON（区域4）（图6b）。硅（Si）因其能量密度高而成为一种很有前途的LIB负极材料，但其商业化却受到体积变化大和循环过程中SEI不稳定的阻碍。通过使用冷冻STEM-EDS层析技术，揭示了硅阳极上三维SEI的降解机制。观察到脱锂后Li2O消失，SEI大幅收缩，表明硅阳极上富含Li2O的SEI不稳定（图6c）。

锂介导的电化学氨合成（LiMEAS）有望避免传统方法的弊端，并具有较高的反应速率和法拉第效率，但锂在LiMEAS中的作用仍存在争议。利用cryo-EM技术探讨了锂的反应性和SEI，发现质子供体控制着锂对固氮的反应性。对于无质子供体和乙醇样品，cryo-HRTEM揭示了类似的马赛克结构，晶体区和无定形区混合。在乙醇样品中，F、O和C元素在样品中均匀分布，而在无质子供体样品中则集中在SEI区域。cryo-EM结果表明，添加乙醇会破坏钝化SEI的形成，从而导致无序的界面形态（图6d）。此外，冷冻电镜还对用于二氧化碳电解的离子聚合物体异质结进行了表征和成像，结果表明该异质结具有良好的气体和离子传输路线，从而揭示了其在工业条件下进行碳氢化合物生产的优异性能。

cryo-EM为直接观察量子材料的原子、电子和自旋结构以及不均匀性开辟了重要途径。这种能力有助于与量子材料的功能相关联，因为许多这些奇特的性质只有在极低的温度下才会显现出来。图6e展示了8 UC厚FeSe薄膜中首次原子分辨成像的界面区域，以及通过使用cryo-EM在10K温度下以双EELS模式的特征谱图。值得注意的是，在2 UC近铁硒层内的Fe L边出现了明显的蓝移，为电子从SrTiO3转移到FeSe提供了直接证据。这一观察结果证实了电子通过栅极电压引向界面对超导性产生的电子带弯曲效应。这表明，SrTiO3衬底在增强超导转变方面起着双重作用，既增加了界面附近的电子密度，又提供了一个能凝聚这些界面电子的高德拜温度声子浴。此外，EELS在FeSe/SrTiO3界面附近发现了红移，这表明通过与SrTiO3界面声子的相互作用，FeSe电子的质量得到了有效提高（图6e）。

总之，cryo-EM在有机物、无机物和界面中的应用展示了其在广泛的材料和应用场景中提供结构洞察力的多功能性，最终增强了我们对各种材料及其功能的理解。与无机物相比，有机物由于其复杂的成分和结构，使用高分辨率技术对其进行研究似乎更具挑战性。从这个意义上说，cryo-CT和ED可以有效地提供整体结构洞察，尤其有助于了解有机材料的形态。至于无机物，通常利用cryo-STEM或cryo-HRTEM来实现原子层面的精细结构表征。界面包括复合结构中的多个相，这需要不同的表征工具来确认它们的存在，如EELS和4D-STEM。

图6. 冷冻电镜在界面方面取得的一些成果。（a）在不同电解质体系中观察到的镶嵌式SEI纳米结构和多层SEI纳米结构的冷冻电镜图像。（b）Li/LiPON界面纳米结构的冷冻电镜图像。（c）Si-SEI复合材料的三维（3D）结构和元素分布的cryo-STEM-EDS层析成像。（d）锂介导的电化学氨合成界面的HRTEM 图像和相应的EELS。（e）STEM图像显示了在 1UC 和8UC-FeSe上生长的10单元胞（UC）封端层 FeTe 的横截面异质结构

总结与展望

尽管cryo-EM在材料科学领域取得了重大进展，并有可能在未来得到更广泛的应用，但仍存在一些挑战。其中一个主要挑战是提高cryo-EM图像的空间分辨率。这需要开发更稳定的样品台、更快的照相机、更精确的漂移校正算法以及更低剂量的电子成像技术。此外，还应仔细研究cryo-EM分析异质材料或有机无定形相的能力，并获得可靠和具有代表性的结果。如图7a所示，在结构生物学领域开发的一体化光电联用显微镜（CLEM）方法有可能解决这一难题。CLEM可在微米尺度上进行完整成像，提供功能信息，同时可在纳米尺度上分析同一细胞，获得精确的结构和组成信息。在冷冻电镜室中加入多种探针，如拉曼探针或红外探针，也有助于提取与晶体材料共存的无定形或有机结构的必要信息。机器学习和高通量计算可用于设计自动取样和筛选方法，提供更真实的结构信息收集过程。一个成功的例子是，科学家们将cryo-EM与人工智能相结合，掀起了结构生物学研究的新浪潮。DeepMind开发的人工智能程序AlphaFold已被用于高精度预测许多蛋白质的结构，在蛋白质复合物结构建模方面与实验方法相比具有竞争力（图7b）。通过利用复杂的算法和机器学习，像AlphaFold这样的人工智能平台有能力以更高的精度和效率揭示复杂的分子结构，而这在以前仅通过实验方法是难以实现的。此外，与材料科学领域通过二维投影获得的TEM图像相比，cryo-ET很少使用，但可以将其引入材料分析，同时获得三维结构。开发操作或时间分辨cryo-EM也很有必要，因为它可以观测材料演变的全过程，并捕捉低温下快速化学反应的瞬变中间态。图7c是一个实例，它在人工智能的支持下成功揭示了人类蛋白酶体的动态演化过程。在目前的早期阶段，ML增强数据分析主要集中在成像处理方面，以提取原子、形态和微结构特征，而在实现自动电子衍射和光谱分析方面也取得了一些令人瞩目的进展。我们相信，原位TEM与ML增强分析之间的深度协同作用将继续推动能源材料研究迈上新台阶。最后，应为各种系统建立标准化的cryo-EM工作流程和协议，以促进行业进步。

总之，cryo-EM在材料科学中的应用已被证明是克服传统电子显微镜局限性的有力工具，并已取得重大进展。结构生物学的宝贵见解，如自动样本采集、大数据统计分析和三维结构重建，也能为材料研究带来益处。然而，实现这些目标需要计算机科学家、成像专家和材料研究人员之间的合作。此外，原位技术和人工智能的成熟很可能会在解决材料科学的基本科学问题方面带来进一步的突破。有了这些进步，cryo-EM在材料科学领域的前景值得期待。

图7. 未来低温电镜的一些新进展。（a）相关CLEM电镜策略。（b）结合人工智能的结构预测。（c）人蛋白酶体的时间分辨冷冻电镜

文章信息

原文链接：https://www.chinesechemsoc.org/doi/10.31635/renewables.024.202300046

文章信息：Weiping Li, Suting Weng,* Dong Su, Xuefeng Wang.* Expanding the Cryogenic Electron Microscopy from Biology to Materials Science. Renewables, 2024, 2(1): 73-87.

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作者简介

王雪锋，中国科学院物理研究所特聘研究员、博士生导师。2016年博士毕业于中国科学院物理研究所，之后在美国加州大学圣地亚哥分校完成博士后工作。2019年入职中国科学院物理研究所。主要从事高能量密度二次电池(锂离子电池、金属锂电池和全固态电池等)关键材料结构和界面表征、机理研究和失效分析，尤其擅长采用冷冻电镜技术研究辐照敏感材料。至今已在Nature、Nature Materials、Chemical Reviews、Joule、Energy & Environmental Science、Journal of American Chemical Society、Nano Letters 等国际知名学术期刊上发表学术论文120余篇，引用9800余次。

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