摘要：1976年circRNA分子被发现，经过30多年的沉寂后，在2013年一鸣惊人，并在随后几年时间里迅速成为新一代明星分子。本文将从circRNA的定义、发现、主要特征、形成模式、作用机制、以及最新研究进展方面，介绍circRNA的研究思路。文末有福利！
一、circRNA的定义
circRNAs（CircularRNAs，环形RNA分子）是一类不具有5‘ 末端帽子和3’ 末端poly(A)尾巴、并以共价键形成环形结构的客观存在于生物体内的非编码RNA分子。
二、circRNA的发现
1976年，在电子显微镜下观测到真核细胞的细胞质中存在环状RNA分子。
1993年，在小鼠中发现其Sry基因存在环状转录。
2012年，借助于高通量测序技术，circRNA被大量发现。
2013年，Nature杂志同一期刊登两篇circRNA研究文章（图1，图2），自此circRNA相关研究快速增长，逐渐成为非编码RNA领域新的明星分子。
图1--circRNA是一大类具有调控作用的动物RNA分子
图2--天然circRNA分子作为miRNA海绵而发挥作用
circRNAs能隐藏这么多年不为人所知，主要因为以下几个原因：
1、当使用线性基因组作为引物设计模板时，传统的逆转录酶-rtPCR无法区分环状和线性RNA。
2、circRNA没有映射到线性参考基因组，所以在测序数据中，序列读取的序列会被丢弃。
3、circRNA缺少polyA尾巴，而RNA测序文库制备时通常都会去除rRNA的polyA。
三、circRNA主要特征
1、circRNA由特殊可变剪切产生，大量存在于真核细胞的细胞质中，主要来源于外显子，少部分内含子来源的circRNA存在细胞核中。
2、表达水平具有种属、组织、时间特异性。
3、circRNA呈闭合环状结构，不易被核酸外切酶降解，比线性RNA更加稳定。
4、具有一定序列保守性。
5、在转录或转录后水平发挥调控作用。
6、绝大多数circRNA是非编码的，但也有少数可以翻译为多肽。
四、circRNA的形成模式
circRNA根据其来源可分为三类：外显子来源的circRNA（exonic circRNAs），内含子来源的circRNA（circular intronic RNAs），以及由外显子和内含子共同组成的circRNA（retained-intron circRNAs）。
circRNAs的形成不同于线性RNA的标准剪切模式，是通过backsplicing方式剪切而来。现有的circRNA形成模型主要由以下5种（图3）：
1、exon skipping；
2、direct backsplicing；
3、环状内含子RNA（ciRNAs）形成模式；
4、依赖于RBPs环化模式；
5、类似于可变剪切的可变环化模式。
图3--circRNA形成模式
五、circRNA的作用机制
circRNA曾一度被认为是正常拼接过程的错误。近年来，circRNA相关研究爆炸式增长，circRNA被发现是正常细胞分化和组织稳态以及疾病发展中的重要参与者，而且circRNA的表达通常不与宿主基因表达相关。这表明circRNA不仅仅是mRNA剪接的稳态副产物，而是新型调控的可变剪接的产物。序列保守性分析也证明circRNA具有重要的非编码功能。
1、作为miRNA分子的海绵，circRNA含有大量的miRNA结合位点，具有miRNA海绵作用，进而间接调控miRNA下游靶基因的表达（图4）。例如第一个被揭示具有调控功能的circRNA--ciRS7，它作为miR7的海绵，含有miR7的470个保守结合位点。ciRS7在人体的许多组织中稳定表达，通过抑制miR7活性来增加miR7靶基因的表达水平。而miR7直接靶向几种致癌基因，涉及许多不同的人类癌症。
图4--circRNA对miRNA的调控
2、作为蛋白分子的海绵，有些环状RNA上有一个或者多个RNA结合蛋白的结合位点，可作为蛋白分子的海绵体。
3、引起免疫响应，有些内源性环状RNA在抗病毒反应中发挥作用，而有些环状RNA与免疫响应相关，外源性环状RNA可以通过激活模式识别受体RIG-I刺激哺乳动物细胞的免疫信号。
4、编码功能，circRNA虽然属于非编码RNA，但是也有少数circRNA可以编码多肽，通过编码多肽行使调控功能。
六、circRNA的最新研究进展
1、功能性环状RNA筛选工具
2020年12月7日，中科院上海生科院陈玲玲、杨力、李劲松团队合作，在 Nature Methods 杂志发表了题为：Screening for functional circular RNAs using the CRISPR–Cas13 system 的研究论文。
该研究开发了基于CRISPR-Cas13d的筛选工具——CRISPR–RfxCas13d，能够快速筛选和发现功能性circRNA。
该筛选工具通过gRNA靶向circRNA的反向剪接位点（BSJ），可有效区分circRNA与线性mRNA。基于该技术，研究团队构建了靶向人类高表达circRNA的反向剪接位点序列的慢病毒文库，使用该筛选文库，研究团队发现了一组对细胞生长、胚胎发育等有重要作用的功能性circRNA。
详情：2、线粒体circRNA可作为非酒精性脂肪肝炎治疗靶标
2020年9月14日，中山大学孙逸仙纪念医院苏士成、许小丁及中山大学附属第三医院高志良作为共同通讯作者，在国际顶尖学术期刊 Cell 在线发表题为：Targeting Mitochondria-Located circRNA SCAR Alleviates NASH via Reducing mROS Output 的研究论文。
该研究确定了一种线粒体特异性circRNA——SCAR，在非酒精性脂肪性肝炎（NASH）中表达下调，向线粒体特异性递送SCAR，可降低线粒体活性氧（mROS）输出，减轻炎症，可作为非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的治疗靶标。
详情：3、体内特异性敲低circRNA
2020年8月11日，美国布兰迪斯大学的研究人员在 Cell Discovery 杂志发表了题为：An in vivo strategy for knockdown of circular RNAs 的论文。
该研究描述了一种组织和细胞分辨率的体内特异性敲低circRNA的方法，利用靶向circRNA特异性反向剪接处的shRNA特异性敲低circRNA，且没有脱靶效应。
这一策略提供了在细胞和个体水平全面研究circRNA的方法，研究团队使用该策略首次产生了特定circRNA被下调的果蝇。
七、circRNA的研究思路
上文介绍了circRNA的几种作用机制，作为miRNA海绵；作为蛋白分子海绵；引起免疫响应；编码多肽。其中第一种——作为miRNA海绵，相关研究最多。
1、 验证 circRNA 的表达水平；
2、通过网络数据库， 预测 circRNA 可能结合的 miRNAs；
3、circRNA 结合的 miRNAs 的信息学筛选及荧光素酶进一步筛选验证；
4、miRNA 靶基因预测与功能富集分析；
5、miRNA 靶基因的筛选、 验证及相关功能研究；
6、circRNA-miRNA-mRNA 调控网络的验证。
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参考文献：
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9、Pamudurti, N.R., Patop, I.L., Krishnamoorthy, A. et al. An in vivo strategy for knockdown of circular RNAs.[J] .Cell Discovery, 2020.
原标题：《circRNA：环状RNA的前世今生、最新进展，及研究思路》